本文发表在以下DovePress期刊上：国际纳米医学杂志

　　背景：肿瘤转移是导致全球大多数癌症死亡的原因，缺乏治疗。

　　目的：本研究的目的是消除肿瘤并控制肿瘤转移的发展。

　　方法：在这里，我们演示了一个智能的纳米平台，其中2- [2-[2-氯-3-[(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2h-吲哚-2 -亚丙基]亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基] -3,3-二甲基-1-丙基碘化碘鎓(IR780)和替拉帕明(TPZ)共同负载在聚(ε-己内酯)-聚(乙烯)中乙二醇(PEG-PCL)形成通用的纳米颗粒(PEG-PCL-IR780-TPZ NP)。

　　结果：系统的智能反映在触发和控制的工程中。特别地，PEG-PCL不仅延长了IR780和TPZ的循环时间，而且还通过增强渗透性和保留(EPR)效应促进了纳米药物在肿瘤中的蓄积。而且，由IR780产生的活性氧(ROS)受到808 nm激光辐照引起了货物释放。同时，IR780作为靶向线粒体的光疗剂，加重了肿瘤的低氧微环境，并激活了TPZ，以完成缺氧激活的化学疗法。最重要的是，IR780能够在协同治疗期间触发免疫原性细胞死亡(ICD)。 ICD生物标记物作为“危险信号”加速树突状细胞(DCs)的成熟，并随后激活了毒性T淋巴细胞。

　　结论：最终，光疗和缺氧激活的化学疗法相结合刺激的抗肿瘤免疫反应彻底改变了目前的癌症治疗方法，显着抑制了肿瘤转移，为临床应用提供了广阔的前景。

　　关键词：光疗，缺氧激活化疗，IR780，替拉帕明，抗肿瘤免疫应答，转移

　　抗肿瘤策略方面的优势取得了长足进步，由于肿瘤的复发和转移，肿瘤的死亡率仍然很高。[1-8]免疫治疗由于其控制远处转移性肿瘤的功能而备受关注[9]。 –11特别是，检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法被认为是治疗癌症的关键工具。12–20然而，由于严重的副作用，高成本和高成本，这两种策略的应用受到限制。个体差异较大。21-24更严重的是，一些肿瘤组织，尤其是三阴性乳腺癌(TNBC),经过检查点抑制剂治疗后的免疫应答相对较低，这主要归因于“冷”免疫微环境。4因此，探索实现“热”免疫微环境并触发免疫应答作为免疫治疗的前奏的新颖而有效的方法。尤为关键。

　　据报道，免疫原性细胞死亡(ICD)是一种刺激性的情况，可将“冷”免疫微环境变为“热”免疫微环境。25-27光疗作为微创治疗策略已显着应用于肿瘤消融。28-35最近的一份报告描述了光疗在激光照射下诱导了ICD。36除了光疗之外，还证实了其他一些ICD诱导剂，包括化学疗法和电离辐射。23,37,38但是，一些不可忍受的局限性，例如低药物输送，可忽略货物放行和单一治疗方案极大地限制了ICD的结果。高度期望智能通过对肿瘤反应性药物纳米载体的工程设计，光疗和化学疗法的合理组合能够协同作用，针对有限的ICD功效提供积极的突破。但是，几乎没有什么工作可以达到理想的高效率。

　　在这项研究中，我们将PEG-PCL-IR780-TPZ NPs(图1)定制设计为一种健壮的纳米载体系统，可高效递送光疗剂(IR780)和化疗前药(TPZ)。 IR780在808 nm激光照射下产生的1O2(ROS之一)在磷脂双层受损后从PEG-PCL-IR780-TPZNPs中释放IR780和TPZ，并同时释放。39-41IR780作为由于线粒体的光疗敏感性，靶向线粒体的光疗剂能够提高治疗效果。42,43Yang等人报道，TPZ作为一种可缺氧激活的前药，对正常细胞几乎没有影响，但具有选择性对低氧细胞有高毒性。44-46他们还证明了IR780光动力疗法过程中会加剧肿瘤缺氧的微环境，这会通过单电子还原反应刺激TPZ产生有毒的氧化自由基物质(羟基自由基和苯并三嗪基自由基)47。激活的化学疗法通过产生大量内源性增效剂，包括高运动性第1盒(HMGB1)，三磷酸腺苷(ATP)和钙网蛋白(CRT)，引发ICD介导的适应性免疫反应。48-50此外，内源性增效剂被识别树突状细胞(DC)并促进DC成熟。51因此，成熟的DC募集幼稚T细胞以激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，包括簇分化(CD)8 + T，CD4+T和NK细胞。 ，然后消融原发肿瘤并控制肿瘤转移。48,52,53总之，我们的研究提供了三个重要发现。首先，我们公开了一种具有纳米功能的触发和控制的纳米车辆。其次，我们强调了PEG-PCL-IR780-TPZ NP的光疗可加重肿瘤的缺氧并引发缺氧激活的化学疗法。第三，我们揭示了联合光疗和缺氧激活的化学疗法刺激的抗肿瘤免疫反应可显着抑制肿瘤转移。

　　图1示意图显示了用于肿瘤消融和转移抑制的免疫疗法。激光照射后，由聚乙二醇-聚己内酯-2- [2- [2-氯-3-[(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2H] -吲哚-2-亚丙基)亚乙基] -1-环烯-1-基]-乙烯基] -3,3-二甲基-1-丙基-1H-碘化碘-替拉帕明纳米颗粒(PEG-PCL-IR780-TPZ NPs)-基于协同的光疗和缺氧激活的化学疗法。损伤相关分子模式(DAMP)包括三磷酸腺苷(ATP)，高运动性第1族框(HMGB1)和钙网蛋白(CRT)作为内源性增强剂产生，并随后促进树突状细胞(DC)成熟。最终，幼稚的T细胞被成熟的DCs募集，并产生包括CD8 + T，CD4 + T在内的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，并诱导自然杀伤(NK)细胞，在消融原发肿瘤和控制肿瘤转移中起着不可或缺的作用。

　　2.1. 材料

　　替拉帕明(TPZ)，ε-己内酯，2- [2- [2-氯-3-[(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2h-吲哚-2-亚烷基)亚乙基]-亚乙基]- 1-环己烯-1-基]乙烯基] -3,3-二甲基-1-丙基-碘化亚碘鎓(IR780碘化物)，2,2,6,6-四甲基哌啶-(TEMP)二甘醇和N，N'-二甲基甲酰胺购自Sigma-Aldrich(中国上海)。(3-(4,5)-二甲基噻唑偶氮(-z-y1)-3,5-二苯基四氮唑鎓)MTT分析，4'，6-二mid基-2-苯基吲哚(DAPI)，钙黄绿素-AM /碘化丙啶(PI )双重染色测定，Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，无血清RPMI-1640培养基和胎牛血清(FBS)从KeyGen Bio-tech Co.，Ltd.(中国南京)获得。白介素12(IL-12)ELISA试剂盒，异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗小鼠CD11c抗体，抗钙网蛋白(CRT)抗体，FITC结合的抗小鼠CD4抗体，P-藻红蛋白(PE)结合的抗小鼠CD83抗体，与藻蓝蛋白(APC)结合的抗小鼠CD8抗体，与Peridinin-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)结合的抗小鼠CD86抗体，与PE结合的抗小鼠CD69抗体和发光ATP检测法都是由Abcam(中国上海)带来。 HMGB1 ELISA试剂盒，抗小鼠CD31抗体和抗小鼠CD8抗体购自Bioss(中国北京)。抗兔二抗-Alexa Fluor 488和其他荧光抗体来自Beyotime生物技术研究所(中国南京)。所有化学试剂均未进一步纯化。将小鼠源性乳腺癌细胞系4T1细胞培养在生长培养基中，该培养基从上海生物科学研究所(中国上海)的细胞库中获得。所有无特定病原体(SPF)的小鼠均购自扬州大学比较医学中心(中国扬州)，并饲养在无病原体的环境中。实验中使用的是去离子水，该水是从Milli-Q(Millipore，18.2MΩcm-1)。

　　PEG-PCL-IR780-TPZ纳米粒子的制备

　　如前所述进行聚(ε-己内酯)-聚乙二醇(PEG-PCL)的合成程序。54使用水包油型乳液溶剂扩散法制备PEG-PCL-IR780-TPZ纳米粒子(NP)。裂解法。54,55 Briey，将IR780(2.5mg)和TPZ(2.5mg)溶解在10 mL二氯甲烷中，并将PEG-PCL溶解在10 mL去离子水中。将它们混合并在超声作用下自组装。超声处理1小时后，成功合成了PEG-PCL-IR 780-TPZ NP，并通过离心沉淀。随后，将样品用去离子水洗涤三次，并在4℃下保存。

　　PEG-PCL-IR780-TPZ NP的表征

　　PEG-PCL NP和PEG-PCL的形态和大小-IR780-TPZ NPs使用透射电子显微镜(TEM，JEOL-200CX，日本东京)直接捕获。通过Zetasizer Nano-ZS90(英国，DLS)测量每种颗粒的流体动力学直径。使用UV-3600分光光度计(Shimadzu，Tokyo，Japan)确定UV-vis吸收光谱，以确保亲水性小分子成功地包封在PEG-PCL NP中。通过紫外可见分光光度计测定的IR780和TPZ的标准曲线分别计算了IR780和TPZ的载药量和包封效率。载药量和封装量的计算公式如下：

　　另外，将PEG-PCL-IR780-TPZ NPs在37°C的胎牛血清(FBS)或磷酸盐缓冲液(PBS)中溶解8天，以研究其稳定性。随后，使用DLS仪器监测流体力学直径。 808纳米二极管激光器(LEO光子公司)用于研究光疗。激光装置的纤维直径为200μm，借助光学透镜可以将光束直径扩大到11.4 mm，从而暴露出整个肿瘤区域。 TEMP自旋俘获电子顺磁共振(EPR)技术用于进行单重态氧的检测。 PEG-PCL-IR780-TPZ NP和ICG对Na2-ADPA的分解速率为

　　在不同的照射时间记录，并通过Na2-ADPA在378 nm处的吸收强度变化进行定量。参考一些报告计算了1O2量子产率。56-58

　　体外红外(IR)成像

　　PEG-PCL-IR780-TPZ NPs的体外光热特性是使用热成像相机(Fotric 226，中国上海)在808 nm激光辐照下以密度递减(1.5 W / cm2，1.0 W /平方厘米，0.5瓦/平方厘米，0.25瓦/平方厘米)。之后，PEG-PCL在1.0瓦/平方厘米的激光功率密度下，将6孔板中具有不同IR780浓度(0、50μg/ mL和200μg/ mL)的-IR780-TPZNPs溶液进一步照射10分钟。

　　体外ROS /缺氧检测

　　使用ROS-ID®缺氧/氧化应激检测试剂盒(ENZO，南京，中国)评估ROS /缺氧效果。首先，收获4T1细胞并将其接种在含有补充有10%FBS的DMEM的6孔板中12小时。孵育后添加IR780(200μg/ mL，根据IR780)，PEG-PCL-IR780(200μg/ mL，根据IR780)和PEG-PCL-IR780-TPZ(200μg/ mL，根据IR780)。随后，将细胞暴露于808 nm激光(1 W / cm2)的照射下5分钟。然后在黑暗中将缺氧检测溶液再添加到6孔板中20分钟。最后，将细胞用PBS洗涤3次，然后使用IX73荧光显微镜(日本奥林巴斯)捕获图像。

　　MTT测定

　　使用MTT分析评估了PEG-PCL-IR780-TPZ NPs的体外细胞毒性。首先，将4T1细胞培养在96孔板中，每孔2×103个细胞，然后在37°C和5%CO2的含10%FBS的DMEM中孵育。孵育12小时后，将细胞与不同浓度的PEG-PCL-IR780NP，PEG-PCL-TPZ NP和PEG-PCL-IR780-TPZ孵育NP12小时。这些组或者用激光(1.0W /cm2)辐照5分钟或者不辐照5分钟。之后，将MTT溶液(5µL)加入96孔板中。再过4小时后，弃去上清液，加入150µL二甲基亚砜(DMSO)溶解晶体。最后，用酶标仪(Tecan，200 Pro NanoQuant，瑞士)测量光密度(OD)。

　　钙黄绿素-AM / PI双重染色测定

　　钙黄绿素-AM / PI双重染色用于评估细胞活力。简而言之，将4T1细胞在37°C和5%CO2的条件下接种到6孔板中12小时。将细胞与不同浓度的PEG-PCL-IR780NP和PEG-PCL-IR780-TPZ NP孵育12小时，然后暴露于808 nm激光照射(1.0 W / cm2)5分钟或不暴露5分钟。进行钙黄绿素-AM / PI共染色，并使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，Olympus，FV1000，东京，日本)捕获活细胞和死细胞的荧光图像。数据由ImageJ分析。

　　体外ICD生物标志物分析

　　为了评估免疫原性细胞死亡(ICD)生物标志物的体外水平，将4T1细胞与IR780(200μg/ mL，根据IR780)，PEG-PCL-IR780 NP(200μg/ mL，根据IR780)共培养以及PEG-PCL-IR780- TPZ NP(200μg/ mL，根据IR780)。孵育12小时后，是否进行808 nm激光照射5分钟(激光的功率密度为1 W / cm2)。再过3小时后，收集上清液以通过ELISA和化学发光测定试剂盒(发光ATP检测测定法(Abcam))检测HMGB1和/或ATP的释放。接下来，将4T1细胞用PBS洗涤两次，并用低聚甲醛(4%)固定15分钟。 PBS清洗后，牛血清白蛋白(BSA，6%w / v，孵育：60分钟)用于阻断抗体的非特异性结合。然后将4T1细胞与一抗(抗CRT抗体，稀释度1：100)在4°C孵育过夜。然后，将细胞用PBS洗涤3次，并与Alexa Fluor 488偶联的二抗(稀释度为1：100)在室温下于室温孵育60分钟。最后，洗涤细胞并用DAPI溶液染色。使用CLSM捕获荧光图像。

　　直流成熟度评估

　　为了研究DC的成熟，根据报道的方法从小鼠骨髓中收集了骨髓DC(BMDC)。59首先，将健康的BALB / c小鼠(5周龄)处死，并收集骨髓细胞。特定的无病原体状况。添加红细胞裂解液以纯化BMDC。之后，将细胞在补充有10%白细胞介素4(IL-4，10 ng /mL)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，10 ng / mL)的无血清RPMI-1640培养基中培养。 37°C，5%的二氧化碳。孵育7天后，获得了纯化的BMDC。同时，将细胞与IR780(200μg/ mL，根据IR780)，PEG-PCL-IR780NP(200μg/ mL，根据IR780)和PEG-PCL-IR780-TPZNP(200μg/ mL)孵育。至IR780)。使用808 nm激光照射(1 W / cm2，5分钟)持续24小时以触发DC成熟。用FITC偶联的抗小鼠CD11c抗体，PE偶联的抗小鼠CD83抗体，PerCP偶联的抗小鼠CD86抗体对细胞染色，然后使用流式细胞仪进行评估。同时，使用IL-12 ELISA试剂盒作为试剂方案评估上清液中的IL-12效应子水平。

　　异种移植小鼠的肿瘤模型

　　健康的雌性BALB / c小鼠(5周龄)是从扬州大学比较医学中心购买的，该小鼠生活在无特定病原体的环境中。动物实验获得南京大学护理委员会的批准(包括动物护理和使用指南以及小鼠安乐死的指南，协议编号：20180212-013)。皮下注射每只小鼠总共5×106 4T1细胞。使用游标卡尺每三天监测一次肿瘤体积。小鼠在右腋下接种4T1细胞后三天，通过尾部静脉注射第二批4T1细胞(5×106)，以建立人工模拟转移模型。

　　体内红外成像

　　使用红外(IR)热像仪评估光热效应，以确保体内有效治疗。向患有4T1肿瘤的简陋小鼠静脉注射PBS或PEG-PCL-IR780-TPZ NP(1.5 mg / kg，根据IR780)。 12小时后，用808 nm激光以1 W/ cm2的功率密度照射4T1荷瘤小鼠10分钟。使用FotricAnalyzIR软件分析了所有热图。

　　体内抗肿瘤功效

　　为了评估PEG-PCL-IR780- TPZNP的治疗效果，将携带4T1肿瘤的小鼠随机分为四组，包括PBS，IR780(1.5 mg / kg，根据IR780)，PEG-PCL-IR780(1.5) mg /kg，根据IR780)和PEG-PCL-IR780-TPZ(1.5 mg / kg，根据IR780)。 PBS组的小鼠接受100μLPBS作为阴性对照。其他组的小鼠通过静脉注射用100μL纳米颗粒处理，然后进行808 nm激光照射(1 W/ cm2)5分钟。记录平均肿瘤体积。相对肿瘤体积(RTV)的计算如下：RTV = V / V0，其中V代表每三天记录的体积，而V0代表原始体积。最终处理后，对小鼠进行人道牺牲以收获主要器官，并对其进行进一步的组织病理学分析。

　　组织病理学分析

　　收集器官和肿瘤组织，用PBS洗涤3次，然后立即固定在多聚甲醛溶液(4%w / v)中一天。之后，将组织包埋并切成30μm切片。最后，使用免疫组织化学(IHC)染色(Ki67和HIF)，免疫荧光染色(CD31)以及苏木精和曙红(H&E)对切片进行染色。、

　　体内微正电子发射断层扫描(PET)成像

　　肿瘤缺氧的评估是使用micro-PET成像进行的。每个治疗组中的小鼠(PBS，IR780 +激光，PEG-PCL-IR780 +激光和PEG-PCL-IR780-TPZ+激光)静脉注射18F-氟嘧啶(18F-FMISO，75μCi/小鼠，100μL)。然后，使用Inveon小动物PET/CT系统对小鼠的肿瘤缺氧进行照相(宾夕法尼亚州西门子)。所有图像均使用Inveon Software(Siemens，PA)重建。

　　肺转移评估

　　使用如上所述建立的人工模拟肺转移模型研究了肺转移抑制作用。具体来说，在治疗后22天，肺转移小鼠被人道地牺牲了。收集肺并洗涤。切除的肺中可见的白色结节表明肺转移。通过奥林巴斯显微镜仔细计数肺转移性结节的数目。浸泡在溶液(4%w / v多聚甲醛)中的切除肺的H&E染色也用于评估组织学和病理学。

　　体内抗肿瘤免疫力评估

　　为了评估体内抗肿瘤免疫力，使用CRT的免疫荧光技术对肿瘤组织切片进行染色。使用免疫组织化学(IHC)研究了肿瘤中CD8 + T细胞的渗透。简而言之，收获肿瘤组织并进一步消化成离散的单细胞。随后，从悬浮液中吸出离散细胞，并使用PerCP偶联的抗小鼠CD86抗体和FITC偶联的抗小鼠CD11c抗体进行标记，以鉴定成熟的DC。使用APC偶联的抗小鼠CD8抗体，FITC偶联的抗小鼠CD4抗体和PE偶联的抗小鼠CD69抗体分别鉴定CD8 +细胞和CD4 + T细胞。最后，利用流式细胞术鉴定活化的效应细胞。

　　体内生化分析

　　将小鼠血液和组织收集到乙二胺四乙酸钠(EDTA)抗凝管中，以评估PEG-PCL-IR780-TPZ NP在体内的细胞毒性。进行了生化分析以检测体内的系统副作用，包括红细胞(RBC)，白细胞(WBC)，血红蛋白浓度(HGB)，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和均值血红蛋白浓度(MCHC)。血小板水平(PLT)是评估脾功能的重要指标。

　　统计分析

　　所有统计分析均使用单向方差分析进行。所有数据均以平均值±标准差表示偏差。 * P值<0.05表示显着差异。

　　结果与讨论

　　PEG-PCL-IR780-TPZ NP的表征

　　PEG-PCL NP和PEG-PCL-IR780-TPZ NP的形态如图2A和B所示。PEG-PCLNP的平均大小非常接近PEG-PCL-IR780-TPZ NP的大小。如图2C所示，PEG-PCL-IR780-TPZNP的平均流体动力学直径约为135 nm，略大于PEG-PCL NP的平均流体动力学直径(125 nm)。吸收光谱表明，PEG-PCL在NIR窗口中没有明显的峰(图2D)。但是，PEG-PCL-IR780-TPZ NP的紫外-可见光谱有两个峰，归因于TPZ和IR780，证明TPZ和IR780成功地被PEG-PCL NP包封。图S1和S2分别显示了不同浓度下IR780和TPZ的吸收曲线。根据较早的数据，对IR780和TPZ的标准吸光度与浓度曲线进行了定量(图S3和S4)。 PEG-PCL-IR780-TPZNPs中IR780(3.28%，70.23%)和TPZ(3.33%，71.28%)的载药量和包封效率被计算了。考虑到药物输送系统(DDS)的稳定性是体内应用的先决条件，因此在37°C下将血清或PBS与PEG-PCL-IR780-TPZ NP混合以模拟体内生理条件。如图2E所示，在8天的时间内，大小没有明显变化，说明了PEG-PCL-IR780-TPZ NP作为DDS的出色稳定性。药物释放是智能DDS的重要角色。据报道，过量的ROS会损害PEG-PCL，从而导致随后的货物释放。作为NIR光敏剂的IR780能够产生单线态氧(一种类型的ROS)。我们推测了PEG-PCL-IR780-TPZNP在暴露于808 nm激光的照射下是否能迅速释放IR780。如图2F和图S5所示，在没有激光照射的情况下，未检测到IR780和TPZ从PEG-PCL-IR 780-TPZNPs中释放出来，表明PEG-PCL-IR780-TPZ NPs在循环中相当稳定。 相反，在808 nm激光的照射下，PEG-PCL-IR780-TPZ NP迅速分解，从而牢固有效地释放了IR780和TPZ。

　　因字数限制，文章未完

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